基因重组胰岛素-天演益合有限公司

胰岛素在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位，至今仍是最有效的一种治疗糖尿病药物。胰岛素是由胰腺的胰岛β细胞，受到内源性或外源性的物质如葡萄糖、乳糖、核酸、精氨酸等刺激而分泌的一种蛋白质激素，其中血浆葡萄糖浓度是影响胰岛素分泌的最重要因素。胰岛素的主要生理作用是调节代谢过程，对糖代谢：促进组织细胞对葡萄糖的摄取和利用，促进糖原合成，使血糖降低；对脂肪代谢；促进脂肪酸合成和脂肪贮存，减少脂肪分解；对蛋白质；促进氨基酸进入细胞，促进蛋白质合成的各个环节以增加蛋白质合成。因此，胰岛素是我们体内唯一能降低血糖，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。当胰岛β细胞受损或胰岛素分泌减少时，就会使人体的血糖升高，引起糖尿病。目前，单单我国糖尿病病人已超过3000万。I型糖尿病患者，由于自身胰岛β细胞功能受损，终生需要注射胰岛素以维持生命和生活，约占糖尿病总人数5%。II型糖尿病患者，胰岛素分泌量出现不同程度的不足，通常需要改变饮食、口服药物和胰岛素的联合治疗。

胰岛素是由A和B两条多肽链组成的蛋白质激素。胰岛β细胞首先分泌的是由84个氨基酸组成的长链多肽—胰岛素原(Proinsulin，见下图示)，经专一性蛋白酶(胰岛素原转化酶PC1和PC2)和羧肽脢E的作用，将胰岛素原中间部分(C链)切下，而胰岛素原的羧基端部分(A链)和氨基端部分(B链),通过3个二硫键结合在一起形成胰岛素。A链含21个氨基酸残基，B链由30个氨基酸残基组成，共有3个二硫键，其中2个连接A链和B链，1个在A链内。

成熟的胰岛素储存在胰岛β细胞内的分泌囊泡中，以与锌离子配位的六聚体方式存在。

NASA太空站生长的胰岛素晶体胰岛素锌六聚体的分子结构示意图

第一代胰岛素-动物胰岛素

1921年Frederick Banting与John Macleod合作首次成功提取到了胰岛素。不同哺乳动物（人、牛、羊、猪等）的胰岛素的氨基酸序列和结构稍有差异，其中猪胰岛素与人的最为接近。最早应用于糖尿病治疗的胰岛素注射制剂，一般是猪胰岛素；猪胰岛素与人胰岛素存在1至4个氨基酸的不同，容易发生胰岛素过敏反应，造成注射部位皮下脂肪萎缩或增生，并且由于其免疫原性高，容易出现胰岛素抵抗。

第二代胰岛素-人胰岛素

20世纪80年代，重组人胰岛素成为世界第一个转基因蛋白质药物。人们通过基因工程（重组DNA），应用酵母(啤酒酵母、毕赤酵母或汉逊酵母)或重组中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达制备高纯度的合成人胰岛素，其蛋白质空间结构和生理作用，都和人体自身分泌的胰岛素一样。人胰岛素较少造成过敏反应或者胰岛素抵抗，其稳定性高于动物胰岛素，通常在25℃左右可保存4周。但在起效时间、峰值时间、作用持续时间上不能模拟生理性胰岛素分泌模式，需在餐前30分钟注射、有较高的夜间低血糖风险。

第三代胰岛素-长效和速效胰岛素类似物

20世纪90年代末,科学家对胰岛素结构和生理活性进行深入研究后发现,利用基因工程技术对胰岛素肽链进行局部改动或修饰，改变了胰岛素的药代动力学特征，但仍保持与胰岛素受体结合的能力。基因工程技术，可以改变胰岛素肽链上某些部位的氨基酸组合、改变等电点、增加六聚体强度、以钴离子替代锌离子、在分子中增加脂肪酸链加大与白蛋白的结合,从而可研制出更适合人体生理需要的胰岛素类似物(insulinsimilitude)，包括众多的超短效、短效、中效、长效和超长效胰岛素或胰岛素混合液。

重组胰岛素的工艺开发

人胰岛素市场前景广阔、经济效益巨大、市场竞争激烈，改革工艺、降低成本、提高市场竞争力是各大公司科研投入的热点。重组人胰岛素生产工艺复杂、技术含量高、难度大，对生产各阶段的准确监控是生产工艺改革的前提。因此，围绕生产过程的各种检测方法在不断改进，生产效率不断提高。

（1）用基因工程大肠杆菌分别发酵生产人胰岛素的A、B链，然后经化学氧化法，使两条肽链在一定条件下重新形成正确二硫键配对的活性人胰岛素。这方法缺点较多，目前已较少使用。

（2）用基因工程大肠杆菌发酵生产人胰岛素原，后经加工形成人胰岛素。大肠杆菌系统表达量高，但缺点是小蛋白质表达产物易降解，故常将人胰岛素原连接在一个较大的蛋白质，融合蛋白的表达产物再经过一系列复杂的后加工，产生有活性的人胰岛素。基因重组人胰岛素的主要生产步骤如下：工程菌发酵、提取包含体、包含体中分离融合蛋白、还原融合蛋白中的二硫键、融合蛋白复性、纯化融合蛋白、胰蛋白酶水解融合蛋白、纯化含胰岛素的肽段、羧肽酶B水解含胰岛素的肽段、纯化人胰岛素。

（3）通过基因工程酵母菌发酵生产人胰岛素原，经后加工形成人胰岛素。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1-50 mg/L)，产量低。因此，虽然重组人胰岛素投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略，尤其是对大肠杆菌表达系统的研究更是越来越深入，用大肠杆菌系统表达人胰岛素原的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。